Микробиология — Центр Микробиологии в Киеве

В России в производстве МИБП занято более 50 предприятий, причем 16 из них выпускают вакцины против 28 видов инфекций. В 2000 г. суммарный объем производства МИБП в России составил (в рублевом выражении) 4,06% от общего производства лекарствен­ных средств, на долю вакцин приходилось 80% от общего объема производства МИБП.

Современное производство МИБП основано на высокой куль­туре технологии, знании и практическом опыте, строгой дисципли­не и соблюдении правил ОМР. Несмотря на тяжелые экономичес­кие условия, в России появились предприятия и производственные участки, соответствующие жестким требованиям ОМР. У многих предприятий имеются все предпосылки для выхода на мировой рынок.

Современное производство МИБП во многом зависит от уров­ня используемой технологии. На многих фирмах отказываются от громоздких культиваторов, предпочитая современное оборудова­ние для периодического культивирования со сменой выращивае­мого микроба. Производство МИБП требует специальных усло­вий, обеспечивающих безопасность работы с возбудителями ин­фекционных заболеваний.

На современное производство МИБП должна действовать сис­тема обеспечения качества продукции. Контроль конечной про­дукции является лишь одним из разделов системы обеспечения качества МИБП, основной упор делается на создание условий на производстве, гарантирующих выпуск качественной продукции.

На основе международных правил во многих странах разраба­тываются свои правила по производству биологических препара­тов. В России правила ОМР разработаны в 1994 г., новая редакция правил ОМР по МИБП опубликована в 2003 г.

ОМР включают требования к персоналу производства МИБП, требования к производственным и складским помещениям, обо­рудованию, документации, сырью, материалам, реактивам, про­цессу производства, контролю качества продукции на разных эта­пах производства, требования к упаковке и маркировке продук­ции, к отделу биологического и технологического контроля, правила отбора образцов продукции на контроль, условия транспортиро­вания и хранения препаратов.

Технологический процесс. К основным требованиям, обеспечи­вающим стабильность технологического процесса и получение качественной продукции, относятся:

-    наличие штата квалифицированного персонала, соответству­ющих помещений и оборудования;

-    наличие систем технического обеспечения (вентиляция, по­дача воды, электроэнергии и др.);

-     проведение входного контроля сырья, материалов, реактивов;

-     контроль продукции на отдельных стадиях производственно­го процесса и конечного продукта;

-     определение класса чистоты помещений;

-     соблюдение санитарных норм и правил в цехах и на рабочих местах;

-     ограничение доступа лиц, не занятых непосредственно на производственных участках;

-     валидация оборудования и процессов;

-     метрологический контроль;

-     применение стандартов и референс-препаратов;

-     использование средств механизации, автоматизации и ком­пьютеризации;

-    применение средств объективной регистрации, записывающих устройств и средств сигнализации о технологическом процессе;

-     соблюдение правил фасовки, маркировки и хранения про­дукции;

-     правильное выполнение очистки, мойки и дезинфекции ма­териалов и оборудования;

-     наличие действующей нормативной документации и систе­мы документирования этапов технологического процесса (стандартная операционная процедура— СОП, инструкции, протоколы и др.).

Валидация. Важное значение для производства МИБП имеет валидация — объективное доказательство того, что любой техно­логический процесс идет правильно и соответствует требованиям, указанным в нормативной документации на препарат. Проводит­ся валидация оборудования, технологических процессов и мето­дов контроля. Валидации подлежат:

-     процессы выращивания бактерий, вирусов, культур, стадии очистки, дезинтеграции, инактивации и др.;

-     чистые зоны и помещения;

-     система технического обеспечения производства (вентиляция, подготовки воды, подача пара и т.п.);

-     технологическое оборудование (автоклавы, центрифуги, ла­минарные боксы, термостаты, моечные машины и др.);

-     технологические процессы (мойка стеклопосуды, чистка обо­рудования, стерилизация, лиофилизация и др.);

-     биологические, иммунологические и аналитические методы кон­троля сырья, промежуточных продуктов и готового препарата.

Персонал. Все принимаемые на работу лица должны пройти полное медицинское обследование, включающее бактериологичес­кий анализ на носительство возбудителей дифтерии, кишечных инфекций и туберкулеза. На производство МИБП не допускаются лица, страдающие инфекционными заболеваниями или имеющие открытые (не защищенные одеждой) поражения участков тела. Персонал должен проходить диспансеризацию не реже 1 раза в год, находиться под постоянным медицинским наблюдением и регулярно обследоваться на туберкулез. Работники, осуществляю­щие визуальный контроль препаратов, должны регулярно прове­рять зрение. Производством вакцины БЦЖ и препаратов туберку­лина могут заниматься только лица, состояние которых контроли­руется путем проверки иммунного статуса и рентгеноскопии грудной клетки. Сотрудники, занятые изготовлением препаратов крови и плазмы, должны быть привиты против гепатита В. Работ­ники, занятые производством, хранением, контролем препаратов, и работники вивария, подвергающиеся риску заражения, должны быть привиты соответствующими вакцинами.

Производственные помещения. Здания, в которых размещается производство МИБП, должны быть спроектированы и построены в соответствии с нормами и правилами, предъявляемыми к строи­тельству предприятий медицинской промышленности. Для того чтобы избежать возможных ошибок в соблюдении правил ОМР, целесообразно провести экспертизу проекта строительства или реконструкции зданий и помещений силами Национального орга­на контроля МИБП.

Для помещений, требующих условий асептики, устанавливают­ся классы чистоты. Их 4, начиная с 1-го класса, при котором до­пускается присутствие механических частиц до 3500 в 1 м³ разме­ром 0,5 мкм при отсутствии живых микробов и кончая 4-м клас­сом, допускающим концентрацию частиц до 350 ООО в 1 м³ размером 0,5 мкм и до 200 живых микроорганизмов в 1 м³.

В одном и том же помещении запрещается проводить работу с живыми патогенными микробами или токсинами и инакгивиро- ванным материалом. Производственные помещения должны быть связаны между собой трансферами — передаточными шлюзами от­дельно для перехода персонала и для передачи продукции на эта­пах технологического процесса. Помещения должны иметь глад­кие внутренние поверхности, удобные для уборки, мытья, обра­ботки дезсредствами.

Состав санитарно-бытовых помещений определяется характе­ром производственных процессов. В помещениях должны быть созданы условия для соблюдения санитарно-гигиенического ре­жима, техники безопасности и пожарной безопасности. Помеще­ния для подготовки персонала к работе, для мытья рук, душевые, туалеты должны быть изолированы от производственных помеще­ний и помещений для хранения продукции.

Складские помещения. Предприятия должны иметь складские помещения, которые по размерам, конструкции и размещению соответствуют номенклатуре препаратов и позволяют рациональ­но размещать препараты, проводить уборку и технические опера­ции. Необходимо иметь отдельные помещения для сырья, брако­ванного материала, готовой продукции, находящейся на каранти­не, и продукции, предназначенной для отправки потребителю.

В складских помещениях должны соблюдаться постоянная тем­пература и влажность, которые проверяются не реже 1 раза в сут­ки. Складские помещения должны быть обеспечены необходимым количеством стеллажей, шкафов, поддонов и др. Все препараты, находящиеся в складских помещениях, должны иметь соответству­ющую маркировку. На стеллажах и полках прикрепляются стел­лажные карты, в которых указываются наименование препарата, серия, срок ее годности, количество.

Производственные помещения должен быть доступным и удоб­ным для уборки и дезобработки. Помещения должны иметь на­дежную систему вентиляции, в них должны соблюдаться условия, гарантирующие защиту от выброса инфекционного материала в окружающую среду. При необходимости производственные поме­щения должны иметь аварийное электро-, тепло- и водоснабже­ние, обеспечивающее автономную работу подразделений в случае аварий. Территория, где расположено производство вакцин, дол­жна пройти экологическую экспертизу.

Оборудование на предприятии должно быть размещено таким образом, чтобы обеспечить непрерывность процесса соблюдения техники безопасности, гарантировать асептичность и возможность эффективной уборки помещения. При оборудовании должны быть инструкции по его эксплуатации. Монтаж оборудования должен по возможности производиться так, чтобы автоматические и меха­нические части, обвязка и сервисные участки размещались вне чистой зоны. Элементы оборудования, соприкасающиеся с препа­ратом, не должны подвергаться коррозии или иным реакциям, не должны быть пирогенными или токсичными, должны быть изго­товлены из материала, не оказывающего действия на активность препарата. Смазывающие вещества и охлаждающая жидкость не должны контактировать с продукцией. Все оборудование, включая системы стерилизации и фильтрации воздуха, обработки воды, ди­стилляторы, должно проходить плановый технический осмотр, а его пригодность к дальнейшей эксплуатации — документироваться.

Метрологическая служба. На каждом предприятии должна быть создана метрологическая служба по обеспечению единства и точ­ности измерений на производстве, по организации ремонта, сво­евременной поверки и калибровки средств измерения, по метро­логической экспертизе нормативной документации, инструкций и др., проведению измерений, повышению квалификации работ­ников метрологической службы и др.

На всех этапах технологического процесса используются толь­ко средства измерения, прошедшие государственную метрологи­ческую поверку. На участках, не влияющих непосредственно на качество производимой продукции, могут применяться средства измерения, прошедшие калибровку. Предприятие, производящее калибровку, должно иметь соответствующую лицензию на право проведения калибровки средств измерения.

Стандарты. При разработке, производстве и контроле МИБП широко применяются стандартные образцы (стандарты). Существуют международные стандарты, в том числе стандарты ВОЗ, нацио­нальные стандарты и стандарты предприятия. За основу стандарта ВОЗ берут одну из производственных серий препарата, изученную на предприятии по всем показателям и прошедшую межлаборатор­ные испытания. В этих испытаниях могут участвовать лаборатории нескольких стран, каждая из которых может испытывать предлагае­мые образцы препарата не только с помощью методов, рекомендо­ванных ВОЗ, но и по своим методам. Международные стандарты испытываются на идентичность, активность, влажность, остаточ­ный кислород, микробную контаминацию.

Стандарты ВОЗ обычно готовят в лиофилизированном виде. Основное отличие стандарта от обычной коммерческой серии зак­лючается в том, что он содержит большое количество стабилиза­тора. Срок годности международного стандарта составляет не ме­нее Шлет. Обсуждение результатов коллаборативных испытаний и утверждение стандартов ВОЗ происходят на заседаниях Комите­та по биологической стандартизации.

На основании международных стандартов разрабатываются на­циональные стандарты. Используя национальные стандарты, пред­приятия создают свои производственные стандарты, которые при­меняются для стандартизации сырья, полуфабрикатов и готовой продукции. Референс-препараты не содержат или содержат непол­ный перечень количественных показателей, которые являются обя­зательными для стандартов. Международные стандарты и рефе- ренс-препараты утверждаются на заседаниях Комитета по биоло­гической стандартизации ВОЗ.

Животные. Особые требования предъявляются к виварию. Он должен размещаться в изолированном помещении, иметь автоном­ную систему вентиляции, отдельные помещения для кормокухни, дезинфекционно-моечное отделение, помещение для хранения сухих кормов, клеток и др.

Основными требованиями к качеству лабораторных животных являются возраст, генотип и микробиологический статус. Возраст и масса тела являются условными характеристиками физиологи­ческого состояния животных.

Для контроля вакцин используют инбредных (линейных) или рандомбредных животных. Линейные животные отличаются не­большими индивидуальными колебаниями в чувствительности к антигену и не дают значительной вариабельности в результатах исследования. Рандомбредные животные отличаются от обычных нелинейных животных, которые разводятся без соблюдения ка- ких-либо селекционных правил. Система разведения рандомбред­ных животных препятствует стихийному нарастанию изменчиво­сти в популяции лабораторных животных. С учетом генетических особенностей инбредных животных для каждого вида вакцин можно подобрать свою линию животных, дающую наиболее выраженный иммунный ответ на вакцину.

Важное значение имеет микробиологический статус животных. Микрофлора животных зависит от условий их содержания. Кон­венциональная система содержания, при которой микрофлора животных не контролируется, не предотвращает развитие инфек­ций и неспецифическую гибель животных на любой стадии ис­пытания вакцин. К животным контролируемого качества отно­сятся безмикробные животные (гнотобиоты) и животные без спе­цифических патогенных факторов (8РР-живогные). Для контроля вакцин наиболее удобными являются 8РР-животные, у которых отсутствуют эндопаразиты, патогенные и условно-патогенные бактерии и вирусы. Естественно, для содержания таких животных в виварии необходимо соблюдать особые санитарно-гигиеничес- кие и гнотобиологические правила.

Документация. Для производства любого МИБП необходим ми­нимальный перечень нормативных и разрешительных документов.

Государственный стандарт— фармакопейная статья.

Нормативная документация:

-     фармакопейная статья предприятия;

-     инструкция по применению препарата;

-     регламент производства препарата.

Разрешительная документация:

-     сертификат производства препарата, выданный ГИСК им. JI.A. Тарасевича;

-     лицензия на производство и реализацию препарата, выдан­ная Министерством медицинской промышленности.

В качестве промежуточных технологических документов пользу­ются инструкцией по изготовлению и контролю препарата и экс­периментально-производственным регламентом.

Инструкцией руководствуются при получении 3 лабораторных серий препарата, которые испытываются в авторском отчете на ограниченном контингенте людей, а экспериментально-производ­ственным регламентом — при изготовлении серий вакцин, кото­рые используются для проведения государственных испытаний вакцин.

Для улучшения качества МИБП Национальный орган контроля разрабатывает опережающие требования с целью побуждения произ­водителей вакцин к совершенствованию технологии их получения.

По современным требованиям для всех этапов технологического процесса должны быть составлены подробные описания стандарт­ных операций (SOP), которыми сотрудники предприятия должны руководствоваться при выполнении этих операций. На все виды оборудования должны быть инструкции по их использованию

Идентичность. Для изучения идентичности полученного МИБП проводят исследования с использованием референс-препаратов и следующих методов: спектрофотометрии, аминокислотного анализа на содержание метионина, триптофана и цистина, анали­за участков М- и С-концевой последовательности, пептидного кар­тирования, электрофореза в полиакриламидном геле и иммуно- электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии и других методов. С их помощью удается определить конформа- ционные и другие молекулярные изменения МИБП, которые мо­гут возникать в процессе их изготовления и хранения. Не все ме­тоды, используемые для изучения экспериментальных образцов МИБП, должны входить в нормативную документацию для уста­новления идентичности препарата.

Стерильность. Лабораторный контроль на стерильность прово­дится с помощью анализа мазков и посева на стерильность. Кон­троль на стерильность осуществляется на разных этапах производ­ственного процесса, в ОБТК предприятия и в Национальном органе контроля.

Стабильность. Стабильность МИБП устанавливается путем про­верки его свойств через различные промежутки времени хранения и методом ускоренной термодеградации образцов вакцины при 37 °С в течение 2 нед. Относительно термостабильными препаратами являются МИБП, выпускаемые в лиофилизированном виде. Пос­ле разведения лиофилизированные препараты становятся очень неустойчивыми к влиянию повышенной температуры.

Токсичность. Токсичность МИБП определяют в опытах на мы­шах и морских свинках. Препарат вводят по 1 и 5 человеческих доз соответственно мышам внутрибрюшинно, свинкам подкожно. Препарат считается безвредным, если у животных в течение 7 дней не снижается масса тела и не появляются какие-либо местные и общие реакции.

Пирогенность. Пирогенность МИБП определяется в опытах на 3 кроликах при внутривенном введении 1 человеческой дозы пре­парата. По изменению температуры тела судят об общих пироген- ных свойствах препарата. Препарат считается апирогенным, если повышение температуры от исходного уровня составляет не более 0,6 °С, а сумма индивидуальных колебаний температуры у кроли­ков не превышает 1,4 °С. Важным методом определения пироген- ности является тест на определение содержания эндотоксина, ко­торый позволяет определить концентрацию ЛПС в препарате.

Примеси. Идентификация примесей в МИБП может быть про­ведена с помощью методов иммуноблота, радиоактивного и имму- ноферментного анализа. Если не удается полностью удалить контаминирующие субстанции, необходимо установить допустимые остаточные концентрации этих веществ и доказать, что они не ока­зывают существенного побочного действия на организм привитого.

Для инактивации вируса и бактерий используют химические вещества (формалин, (З-пропиолактон и др.). Необходимо осуще­ствлять контроль на полноту инактивации токсина, вирусов или бактерий и на присутствие инактиваторов в конечном продукте.

Особое внимание должно быть уделено биологическим веще­ствам, которые используются для получения культуры клеток (трип­син) или вносятся в клеточную культуру в качестве ростовых фак­торов (эмбриональная телячья сыворотка и др.).

Стабилизаторы и консерванты. Стабилизаторы (гидролизат же­латина, сорбит, ЛС-18идр.) и консерванты (мертиолат, 2-фенок- сиэтанол и др.) не должны подавлять активность МИБП и вызы­вать побочные реакции. Желатин готовят из коллагена крупного рогатого скота, его использование представляет определенный риск в отношении прионных заболеваний.

Адъюванты. Чаще всего в качестве адъювантов используют соли алюминия или кальция. Концентрация алюминия в конечном про­дукте не должна превышать 1,25 мг и кальция 1,3 мг на 1дозу. Адъюванты, добавляемые к вакцине, должны подвергаться распа­ду в организме. Каждый новый адъювант проходит тщательную лабораторную и клиническую проверку. Для носителей, включен­ных в состав вакцин, должна быть представлена полная характе­ристика структуры, состава и безопасности носителей. В конце срока хранения вакцины определяется концентрация носителя, не связанного с антигеном, которая не должна превышать установ­ленного Национальным органом контроля лимита.

Вода, растворы, реагенты. Вода, растворы, растворители, хими­ческие вещества, используемые для приготовления МИБП, долж­ны удовлетворять требованиям международной или национальной фармакопеи. Среда МИБП (рН) обычно соответствует 6,0-7,0. Вся лабораторная посуда и емкости, используемые для производства МИБП, должны быть изготовлены из материалов, которые совме­стимы с биологической субстанцией и не влияют на ее свойства.

При разработке своих национальных требований к качеству МИБП подавляющее число стран руководствуется рекомендация­ми ВОЗ. Экспертный комитет по биологической стандартизации ВОЗ рассматривает, одобряет и публикует рекомендации практи­чески по всем видам МИБП. В рекомендациях отражены все эта­пы производства и контроля МИБП, начиная с входного контроля сырья и кончая контролем конечного продукта. В документах ВОЗ даются преимущественно качественные показатели МИБП, хотя по наиболее важным из них (безопасность, специфическая актив­ность и др.) приводятся цифровые данные. По большинству пока­зателей лимиты устанавливаются национальными органами конт­роля отдельных стран. Эти показатели в требованиях разных стран могут отличаться друг от друга.

ВОЗ считает целесообразным разрабатывать международные требования только в том случае, если МИБП лицензирован хотя бы в одной стране и на него есть национальные требования. Тем не менее по некоторым новым МИБП, например синтетическим пептидным вакцинам и ДНК-вакцинам, которых еще нет в прак­тике, ВОЗ разработала наставления (1997), носящие общий реко­мендательный характер.

Общие требования касаются прежде всего безопасности и спе­цифической активности МИБП. Для обеспечения безопасности вакцин должны быть изучены и охарактеризованы свойства вак­цинного штамма, клеточного субстрата, свойства полуфабриката и конечного продукта (стерильность, токсичность, пирогенность, хи­мические и биологические примеси, добавки, контаминация и др.).

Требования к специфической безопасности вакцин касаются полноты инактивации токсинов, бактерий, вирусов, отсутствия остаточной вирулентности (или реверсии вирулентности) и конта­минации, наличия генетической стабильности и генетической го­могенности вакцинного штамма.

Специфическая активность вакцин включает такие показатели, как количество антигена в единице объема ^/мл, ЕС/мл), количество живых или убитых микробных клеток, составляющих основу вак­цины, уровень специфических антител в сыворотке крови живот­ных, иммунизированных данной вакциной, степень защищенно­сти таких животных от введения разрешающей дозы инфекцион­ного агента и др.

Посевной материал, который используется для приготовления вакцины, готовится из производственного штамма. Одна и та же серия посевного материала может использоваться в течение десят­ков лет. Для приготовления вирусного посевного материала при­меняют вирус, который прошел минимальное число пассажей от первичного посевного вируса, из которого была приготовлена вак­цина при ее лицензировании. Критерием, ограничивающим число пассажей, является генетическая стабильность вакцинного штам­ма. Следует контролировать посевной вирус на контаминацию. Хранение посевного вируса и процесс производства вакцин не должны менять свойства вируса. Эти требования к посевному ви­русу, используемому для приготовления живых и инактивирован- ных вакцин, должны быть одинаковыми. Штамм вируса, исполь­зуемый для приготовления посевного материала, должен быть ат­тестован и содержать сведения об истории его выделения, методе аттенуации, контаминации, иммуногенности, безопасности, а также о нейровирулентности, если штамм применяется для производ­ства живых вакцин.

Посевной вирус должен содержаться в условиях, обеспечиваю­щих стабильность его генотипа и постоянство свойств при его хра­нении и репродукции.

Первичные и перевиваемые клеточные культуры. Ни один вид клеток, используемых для приготовления вирусных вакцин, не является абсолютно безопасным в отношении возможной конта­минации посторонними вирусами. Каждый вид клеток, который может быть использован для производства вакцин, должен быть охарактеризован по следующим показателям: история линии кле­ток, среда культивирования клеток, характеристика динамики раз­множения клетки in vitro, замораживание и хранение посевного пула диплоидного штамма клеток, кариологическая характеристи­ка, контроль на наличие контаминантов, контроль на неопласти­ческие свойства штамма, аттестация клеточных культур и прото­колы ведения диплоидных клеток.

Первичные клеточные культуры используются для приготовле­ния вакцин уже в течение нескольких десятилетий. Применяются куриные эмбрионы (для вакцин против гриппа, бешенства, кле­щевого энцефалита, желтой лихорадки), эмбрионы японских пе­репелов (для вакцин против кори и паротита), клетки почек обе­зьян (клетки почек зеленых мартышек для изготовления полиоми- елитной вакцины), клетки собак, кроликов, хомяков. К недостаткам метода первичных культур относятся высокая чувствительность к вирусам, возможная предшествующая контаминация, необходи­мость контроля на микробную контаминацию отдельных живот­ных и птиц, а также колоний, где они разводятся.

Диплоидные клетки человека не обладают туморогенностью, и из них можно создать клеточный банк, что удобно для производ­ства вакцин. Вместе с тем для культивирования диплоидных кле­ток необходимы ростовые факторы.

Наиболее перспективными и удобными для производства МИБП являются перевиваемые клетки. К таким клеткам относятся пас­сированные раковые клетки человека и животных. Перевиваемые клетки неприхотливы к питательной среде, из них можно создать банк клеток и получить биомассу в большом объеме. Для приго­товления вакцин следует применять только те клеточные линии, которые не обладают онкогенными свойствами.

Недостатком работы с перевиваемыми клетками является необ­ходимость очистки вакцин от клеточной ДНК, которая теоретичес­ки может обладать туморогенной активностью, вызывать актива­цию протоонкогенов или инактивацию супрессорных генов после встраивания чужеродной ДНК в клеточный геном. Недавно ВОЗ увеличила лимит клеточной ДНК со 100 пг до 10 нг на 1 дозу вакци­ны, хотя современные методы очистки позволяют уменьшить кон­центрацию клеточной ДНК в вакцинах до минимальных концент­раций. Для энтеральных вакцин лимит чужеродной ДНК не уста­новлен в связи с минимальным риском возникновения осложнений.

Трипсин, бычья сыворотка и сывороточный альбумин, необхо­димые для приготовления взвеси клеток и их культивирования, можно использовать только из тех территорий, которые свободны от прионных заболеваний. Для производства МИБП нельзя при­менять клетки нервной ткани.